Гемоглобин — белок эритроцитов, красных кровяных клеток, переносящий молекулярный кислород от легких к тканям в организмах позвоночных животных. Структура, свойства и функции гемоглобина на протяжении последних 150 лет наиболее полно изучены по сравнению с другими белками. Пионерами исследований гемоглобина являются Лайнус Полинг, Макс Перуц, Вернон Инграм, Карл Сингер и их последователи.
Нарушение структуры, модификации и свойств гемоглобина может приводить к осложнениям при кровопотере в постреанимационном периоде. Возникновение различных тяжелых форм анемии, например таких, как серповидно-клеточная, гемолитическая анемии и другие, может приводить к летальном исходу. Поэтому изучение структуры и свойств гемоглобина имеет важное значение в практической медицине и в реаниматологии.
Цель обзора — привести наиболее значимые модификации и превращения молекулы гемоглобина, которые могут быть использованы для выработки стратегии реанимационных мероприятий и лечения жизненно опасных видов анемий.
История исследования гемоглобина
Впервые гемоглобин был обнаружен в 1839 году немецким исследователем Р. Хюнефельдом в крови обыкновенного дождевого червя. Спустя 12 лет другой немецкий ученый О. Функ опубликовал серию статей, в которых он предложил метод получения устойчивых кристаллов гемоглобина или, как их тогда называли, кристаллов крови. Он исследовал кровь из селезенки лошади, собаки и разных рыб.
В 1864 году известный немецкий физиолог Ф. Хоппе-Зайлер предложил название «гемоглобин». Клод Бернар показал, что гемоглобин в красных кровяных тельцах переносит кислород, и что О2 в гемоглобине может замещаться на монооксид углерода.
В 1909 году А. Хиллом была предложена первая модель связывания О2 с гемоглобином, описывающая экспериментальные данные. Согласно этой модели центры связывания О2 на молекулах гемоглобина не являются независимыми. А именно, присоединение одной молекулы О2 к одному из центров увеличивает сродство к О2 других центров, а связывание двух молекул О2 еще более облегчает связывание с третьей. Уравнение, описывающее процесс связывания О2 гемоглобином, называют уравнением Хилла.
В 1910 г. Херрик обнаружил серповидную форму эритроцитов. Решающую роль в биохимическом и генетическом анализе серповидно-клеточной анемии сыграла работа выдающегося химика Л. Полинга. В 1949 г. Лайнус Полинг выявил, что красные кровяные клетки больных этой болезнью становятся серповидными только в венозной крови, где низок уровень содержания кислорода.
На основе знания химии гемоглобина Л. Полинг выдвинул предположение, что серповидная форма красных клеток вызывается генетическим дефектом клеточного гемоглобина. В 1952 г. он доказал, что нормальный гемоглобин и гемоглобин, взятый у больных серповидно-клеточной анемией, можно различать с помощью электрофореза, метода разделения различных белков в смеси. Сделанное открытие подтвердило убеждение Л. Полинга в том, что причина аномалии кроется в белковой части молекулы гемоглобина.
Точная структура гемоглобина стала известна главным образом благодаря работам английского биофизика Макса Перуца. Он впервые провел рентгеноструктурный анализ молекулы гемоглобина в конце 40-х годов ХХ века. За эти исследования в 1962 году он был удостоен Нобелевской премии.
Структура гемоглобина и его модификации
Молекула гемоглобина состоит из четырех субъединиц и включает 574 аминокислоты. Каждая субъединица гемоглобина содержит одну небелковую группу — гем. Гем представляет собой протопорфирин, содержащий центрально расположенный ион двухвалентного железа (Fe2+).
Существует несколько видов генов, кодирующих глобин — белковую часть гемоглобина. В самом деле, последовательность аминокислот гемоглобина немного отличается от одного человека к другому. Разные комбинации глобиновых цепочек формируют разные структуры гемоглобина.
Существуют физиологические и патологические виды гемоглобина. К физиологическим относят три основных типа гемоглобина: примитивный — HbP, фетальный — HbF, взрослый — HbA.
Помимо физиологических, выделяют более 200 форм патологических гемоглобинов, отличающихся друг от друга физико-химическими свойствами, в частности различной электрофоретической подвижностью и разным отношением к щелочам. Причиной возникновения патологических форм гемоглобина является повреждение генов, отвечающих за синтез той или иной цепи гемоглобина.
Среди гемоглобинопатий наиболее известна серповидно-клеточная анемия, связанная с таким нарушением строения белка гемоглобина, при котором он приобретает особое кристаллическое строение — так называемый гемоглобин S (HbS). Серповидно-клеточная анемия является наследственным заболеванием, которое наиболее часто выявляется у людей африканского происхождения.
HbS отличается от обычного НЬА по своей электрофоретической подвижности и по аминокислотному составу, причем изменение аминокислотного состава касается только двух остатков глютаминовой кислоты примерно из 600 аминокислот, входящих в состав молекулы гемоглобина. У гемоглобина S на шестом месте вместо остатка глютаминовой кислоты находится электрически нейтральный валин. Такая замена повышает склонность молекул гемоглобина к полимеризации или кристаллизации.
Для патологических форм гемоглобина характерно изменение структуры полипептидной цепи глобина, когда одна или несколько аминокислот заменены другими или отсутствуют.
У гемоглобина C на шестом месте вместо отрицательно заряженной глутаминовой кислоты находиться положительно заряженный лизин. Этот вариант гемоглобина назван «С» по названию города, у жителя которого была впервые обнаружена мутация — Christchurch (Новая Зеландия), хотя встречается преимущественно в Западной Африке. Эта мутантная форма снижает пластичность эритроцитов организма. HbC образует кристаллы внутри красных кровяных клеток. Образование кристаллов может привести к увеличению вязкости крови, к увеличению жесткости клеток, сокращению срока жизни эритроцитов. Присутствие гемоглобина С в крови человека может спровоцировать такое заболевание, как хроническая гемолитическая анемия.
Гемоглобин Е (HbE) возникает, когда на 26 месте глутаминовая кислота заменена на лизин. Этот мутационный тип гемоглобина наиболее часто встречается у коренного населения Юго-Восточной Азии. В тех случаях, когда присутствует комбинация гемоглобинов С и S, у человека могут возникнуть более тяжелые формы анемии.
Методы исследования
Одним из широко распространенных методов, позволяющих выявить патологические формы гемоглобинов, является электрофоретический метод.
Электрофорез — электрокинетическое явление перемещения частиц дисперсной фазы (например, белковых растворов) в жидкой среде под действием внешнего электрического поля. При определенном значении рН и ионной силы раствора белки движутся в электрическом поле со скоростью, зависящей от молекулярной массы и суммарного заряда. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, движутся к аноду, а положительно заряженные белки — к катоду.
Существует множество разновидностей и модификаций данного метода, которые проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле (ПААГ) и др. Каждый из методов характеризуется различной разрешающей способностью. Например, при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге обнаруживают только 5 главных фракций, а для тех же белков в ПААГ возможно разрешить до 18 различных фракций. Для обнаружения белковых фракций полоски бумаги или столбики геля обрабатывают красителем. Окрашенный комплекс белков с красителем выявляет расположение различных фракций на носителе.
Электрофоретический метод применяется в молекулярной биологии для разделения макромолекул, а также их фрагментов, используется в клинической диагностике, популяционной биологии (для изучения генетической изменчивости) и др.
Для изучения состава различных соединений применяют спектрофотометрический метод, который заключается в изучении спектров поглощения в ультрафиолетовой (200—400 нм), видимой (400—760 нм) и инфракрасной (>760 нм) областях спектра. Он основан на измерении ослабления света и расчете концентрации поглощающего материала по найденной оптической плотности раствора в соответствие с законом Бугера-Ламберта-Бера.
Наиболее информативным методом в исследовании белков и гемоглобина, в частности, является метод рентгеноструктурного анализа. Целью данного метода является установление пространственной структуры белка, т. е. определение расположения атомов в трехмерном пространстве молекулы. Это достигается использованием дифракции рентгеновских лучей на кристаллической структуре белка. Дифракционная карта позволяет получить распределение электронной плотностиp в кристалле и вычислить программными методами пространственную структуру гемоглобина. Именно таким методом были получены структура гемоглобина и его модификаций.
Наряду с рентгеновской кристаллографией для исследования строения белковых молекул использовался метод электронной микроскопии, который реализуется с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ).
В СЭМ поверхность образца сканируется пучком электронов с первичной энергией около 10 кэВ. Облучаемая при таком сканировании поверхность начинает излучать либо так называемые вторичные электроны, либо кванты света, которые регистрируются, усиливаются, преобразуются по интенсивности, после чего подаются на экран электронно-лучевой трубки, создавая видимое изображение поверхности.
В настоящее время наноструктуру и свойства гемоглобина изучают с помощью сканирующей зондовой микроскопии, в частности, атомной силовой микроскопии.
Основной принцип работы атомно-силового микроскопа (АСМ) заключается в силовом взаимодействии тонкой сканирующей иглы (зонда) с поверхностью образца. Энергия взаимодействия U молекул (атомов) образца с иглой зонда определяется потенциалом Ленарда- Джонса.
Сила Ван-дер-Ваальса, действующая на зонд со стороны поверхности, приводит к изгибу консоли. Зарегистрировав величину изгиба, можно сделать вывод о трехмерном рельефе исследуемой поверхности. Кроме этого АСМ позволяет производить измерения в воздушной атмосфере, в жидкости, в вакууме, что открывает широкие возможности для изучения биомолекул.
Основные формы гемоглобина
Гемоглобин при нормальном функционировании организма может находиться в одной из 3-х форм: дезоксигемоглобин, оксигемоглобин и метгемоглобин. В дезоксигемоглобине железо находится в закисной форме — Fe(II), в которой глобин предохраняет железо гема от окисления.
Оксигемоглобин — это результат соединения гемоглобина с молекулярным кислородом, при котором перенос электрона на кислород происходит не от железа, а от имидазольного кольца проксимального гистидина. Взаимодействие молекулярного кислорода со свободным гемом приводит к необратимому окислению атома железа гема, при котором Fe(II) переходит в Fe(III), то есть образуется метгемоглобин.
Действие различных токсинов приводит к модификации гемоглобина. Например, под воздействием NaNO2 оксигемоглобин переходит в форму метгемоглобина. Изменение спектра поглощения гемоглобина отражает это воздействие.
В молекуле дезоксигемоглобина железо не находится в плоскости порфиринового кольца. Из шести 3d-электронов железа Fe(II) два электрона спарены на одной из низших d-орбиталей, их спиновые моменты S=2. Магнитный момент гема в этом состоянии равен ~5,5 боровского магнетона (БМ), а спектр поглощения в зеленой области имеет характерную полоску с Amax~556 нм. Присоединение кислорода ведет к значительным изменениям. Атом железа в оксигемоглобине лежит практически в плоскости порфиринового кольца. Все шесть d-электронов спарены на трех низших уровнях d-орбиталей, S=0, оксигемоглобин диамагнитен. В зеленой области спектра имеются две характерные полосы поглощения: a (Amx~576А) и b (Amax~542А).
В метгемоглобине при нейтральных значениях рН место кислорода занимает молекула воды, железо находится значительно ближе к плоскости гема, чем в дезоксигемоглобине, все 5 d-электронов не спарены и занимают пять d-орбиталей. S=5/2 и магнитный момент равен 5,91 БМ.
Структурные изменения в активном центре приводят к значительным изменениям пространственной структуры всего белка. При оксигенации смещения отдельных аминокислотных остатков достигает 7А. Четвертичная структура гемоглобина характеризуется наличием четырех полипептидных цепей, образующих две а и две бета-субъединицы. Переход от Т к R форме сопровождается поворотом одного димера относительно другого на 12—15° и в конечном счете приводит к увеличению «карманов», в которых находятся гемы. Эти структурные изменения инициируются присоединением первой молекулы O2 к одному из свободных гемов и распространя-ется на всю глобулу. Именно поэтому в равновесной смеси всегда присутствуют только T и R формы.
Кристаллизация и полимеризация белков
Многие формы гемоглобина обладают способностью к образованию кристаллов или полимеров in vitro, некоторые патологические формы могут модифицироваться in vivo. Однако в ряде статей отсутствуют четкие разграничения между кристаллизацией и полимеризацией гемоглобина. Необходимо различать эти понятия.
Кристаллизация — это фазовый переход вещества из жидкого состояния в твердое кристаллическое с образованием кристаллов.
Полимеризация — это процесс образования высокомолекулярного соединения путем многократного присоединения молекул низкомолекулярного вещества (мономера, олигомера) к активным центрам в растущей молекуле полимера.
Чтобы началась кристаллизация, необходимо создать такие условия, в которых белковый раствор становится перенасыщенным, что приводит к белок-белковой агрегации. Для этой цели используют осадители (вещества, уменьшающие растворимость): сульфат аммония, полиэтиленгликоль (ПЭГ), органические растворители. Обычно требуется тщательное изучение условий кристаллизации конкретного белка: рН, концентрации буфера и осадителя, ионов металлов.
Белки принципиально отличаются от хорошо изученных легко растворимых, низкомолекулярных кристаллов. Во-первых, белки имеют большой размер молекул (следовательно, большой размер строительных единиц). Во-вторых, их молекулы гидратированы, то есть имеют водную оболочку, препятствующую их сближению в растворе, поэтому кристаллизация возможна только в присутствии низкомолекулярных солей, разбивающих оболочку. В-третьих, форма белковых молекул весьма сложна, им нужно дополнительное время для изменения конформации, чтобы выстроиться в кристаллическую решетку.
Скорость роста кристаллов зависит от растворимости белка, т. е. от концентрации растворителя. Иногда чтобы вырастить большие кристаллы, в раствор белка вносят затравку — мелкие кристаллы этого белка. Кристалл белка может храниться полгода в специальном растворе, который не содержит белка. Подбирается такая концентрация осадителя, при которой кристалл не растворялся бы и не трескался.
Гемоглобин человека кристаллизуется с трудом, так как он очень хорошо растворим и обычно не осаждается при удалении соли, как это удается сделать в случае гемоглобина лошади. Поэтому для кристаллизации гемоглобина в качестве осадителя чаще всего используют соли с добавлением ПЭГ. В результате получаются плоские кристаллы различной формы в зависимости от вида гемоглобина.
В настоящее время для кристаллизации гемоглобина человека из концентрированных растворов фосфатов или сульфата аммония различными исследователями предложен ряд методов, сходных между собой в том отношении, что все они основаны на использовании явления высаливания. Гемоглобин быка, так же как и гемоглобин человека, очень хорошо растворим и может быть выделен в кристаллическом состоянии, как этими методами, так и осаждением из водного раствора этиловым спиртом. Раствор гемоглобина обрабатывают небольшим количеством спирта для понижения растворимости и оставляют на 2—3 недели при 0°С.
Считается, что серповидно-клеточная анемия — это результат кристаллизации гемоглобина. Серповидно-клеточная анемия — наследственное заболевание системы крови, характеризующееся генетическим дефектом, в результате которого нарушается образование нормальных цепей гемоглобина в эритроцитах. Образующийся при этом аномальный гемоглобин отличается по своим электрофизиологическим свойствам от гемоглобина здорового человека, в результате чего изменяются и сами эритроциты, приобретая удлиненную форму, под микроскопом напоминающую серп. Серповидные эритроциты быстро разрушаются в организме, а также закупоривают множество сосудов по всему организму, что может стать причиной тяжелых осложнений и даже смерти.
Проницаемость мембраны серповидных клеток для различных ионов повышена, что приводит к необратимым изменениям формы эритроцитов.
Пластические способности серповидного эритроцита значительно снижены, он не способен обратимо деформироваться при прохождении через капилляры, и может закупоривать их. Мембрана серповидных эритроцитов отличается повышенной ломкостью, в результате чего продолжительность их жизни значительно укорачивается. Уменьшение общего количества эритроцитов в крови, стимулирует образование эритропоэтина в почках. Это усиливает эритропоэз в красном костном мозге и может частично или полностью компенсировать проявления анемии. На сегодняшний день серповидно-клеточная анемия неизлечима.
Полимеризацию гемоглобина используют в производстве кровезаменителей. Полимеризация гемоглобина in vitro происходит с помощью различных агентов: глутарового альдегида, полиэтиленгликоля, декстрана, гидроксиэтилкрахмала. Полимеризация гемоглобина происходит одинаково в растворах и в клетках. Формирование волокон из молекул гемоглобина возможно только для дезоксигемоглобина. Формирование волокна проходит 2 основных этапа. На 1-м этапе примерно семь молекул гемоглобина должны собраться вместе, чтобы сформировать ядро, которое будет точкой отсчета для будущего волокна.
Патологические формы гемоглобина могут полимеризоваться в эритроците, то есть молекулы гемоглобина слипаются и образуют длинные волокна или стержни. Например, цепь бета2 соединяется с бета1 и этот процесс относительно медленно повторяется, формируя основу для будущей нити. После того, как образуется ядро, начинается 2-й этап процесса. На этой 2-й стадии волокна формируются относительно быстро, потому что молекулы присоединяются к уже существующей структуре.
Коагуляция гемоглобина или гемоглобиновая дегенерация Эрлиха — это неравномерное распределение в эритроцитах гемоглобина как результат процессов, ведущий к коагуляции гемоглобина. При выраженной коагуляции гемоглобина внутри клетки фон эритроцита становиться более светлым. Коагуляцию гемоглобина может вызвать высокая концентрация ионов тяжелых металлов, например цинка.
Значительный вклад в изучение кристаллических особенностей гемоглобинов внес Г. Драбкин. Изучив кристаллографические свойства оксигемоглобинов человека, лошади, собаки, автор пришел к выводу, что форма кристаллов значительно варьирует от вида к виду. Им же было показано, что гемоглобин кристаллизуется в трех формах: моноклинной, ромбической и гексагональной. Видовая специфичность кристаллических форм гемоглобинов подтверждается работами Б. Сухомлинова, Д. Дворниковой и другими.
Ряд авторов отмечают, что кристаллы окси- и дезоксигемоглобина отличаются своей формой. Например, P. Хирш в своей статье показывает, что оксигемоглобин C может образовывать тетрагональные кристаллы, а дезоксигемоглобин C — плоские. P. Наджел отмечает, что тетрагональные кристаллы оксигемоглобина C могут образовываться как in vitro,так и in vivo.
По мнению Кендрью большое влияние на форму кристаллов имеют боковые цепи молекул, в частности, производные имидазола. Коржуев в своей монографии «Гемоглобин» суммирует литературный материал по кристаллизации гемоглобинов, начиная с 1839 года. Он отмечает видовые различия кристаллов этого хромопротеида у различных видов животных.
Френч, Перуц показали с помощью электронной микроскопии отдельные полимерные волокна дезоксигемоглобина-S. Авторы определили, что диаметр волокна равен 200А. Д. Памфри и Д. Стеинхарт в своих исследованиях установили, что дезоксигемоглобин S может вырасти до 1 мм в длину и полностью растворяется при падении температуры до 0°С.
Заключение
Гемоглобин — один из наиболее хорошо изученных белков. Десятки лет исследований гемоглобина во многих лабораториях мира привели к значительному прогрессу в описании и понимании механизмов его кристаллизации и полимеризации.
Сейчас исследование механизмов структурирования различных форм гемоглобина является актуальной и важной задачей для фундаментальных исследований и практической медицины. Процесс роста отдельных кристаллов для рентгеноструктурного анализа представляет большой научный интерес и исследуется во всем мире, поскольку на различных стадиях выращивания до того, как образуется конечный кристалл, могут формироваться и волокнистые структуры, и микротрубочки, и мелкие кристаллы различной формы.
Эти знания необходимы для понимания механизма зарождения волокон, микротрубочек или кристаллов в эритроцитах, содержащих патологические формы гемоглобина (HbS, HbC). Образование таких структур может способствовать лизису клеток, что приводит к нарушению реологических свойств крови, а также метаболических процессов в организме.
Возникновение кристаллов внутри эритроцита может приводить к тяжелым видам гемолитической и серповидно-клеточной анемии. Такие виды анемии могут вызывать летальный исход. Поэтому знание механизмов образования и свойств кристаллических и полимеризованных форм гемоглобина может способствовать правильному выбору стратегии реанимационных мероприятий и лечению больных.
В. А. Сергунова, Е. А. Манченко, О. Е. Гудкова
2016 г.