Разработка эффективных экстракорпоральных систем поддержки функций печени при острой и хронической печеночной недостаточности для решения задач трансплантологии и при токсических поражениях является перспективным направлением современных биомедицинских исследований.
Широко применяемые методы основаны на использовании физико-химических взаимодействий биологических молекул и способны выполнять исключительно детоксикационную функцию (гемодиализ, гемофильтрация, гемодиафильтрация, сорбция, альбуминовый диализ, плазмаферез).
Однако в последние десятилетия наиболее активно разрабатываются системы поддержки, совмещающие функции перфузии крови/плазмы и клеточные технологии для поддержания метаболической, синтетической и регуляторной функций печени, — системы «искусственной печени».
История вопроса
Элементарные сведения о печени и ее сосудах имеются в медицинской литературе Древнего мира. Крупнейший врач и философ Рима К. Гален (Н. Galenus; 131-211) изучал функцию и строение печени. Большой вклад в создание научной анатомии человека внес А. Везалий (A. Vesalius; 1514-1564).
Следует отметить деятельность Ф. Глиссона (F. Glisson; 1597— 1677), который был профессором медицины и анатомии в Кембридже и являлся последователем У. Гарвея. Занимаясь изучением анатомии сердца и топографией сосудов в органах, он впервые описал капсулу, которая покрывает печень. С тех пор она называется глиссоновой капсулой. Ф. Глиссон является автором книги «Анатомия печени» (“Anatomia hepatica”), вышедшей в 1654 г., в которой было впервые подробно представлено строение этого органа.
Большое значение в понимании внутренней архитектоники печени имели работы анатомов Рекса (Н. Rex; 1888) и Кантли (G. Cantlie; 1897). Значительный вклад в изучение строения печени принадлежит К. Куино (С. Couinaud, 1922-2008). Доработанная и предложенная им в 1954 г. концепция сегментарного деления печени и желчных протоков по сей день является основой хирургической гепатологии.
В настоящее время наука, изучающая патологию печени, в связи с большой спецификой выделилась в отдельную дисциплину — гепатологию. Несмотря на длительную историю изучения строения и функционирования печени и по сей день остаются непознанными многие функциональные и регенераторные феномены этого органа.
Печень осуществляет множество жизненно важных функций в организме человека, в основном детоксикационного и синтетического характера. При этом в силу детоксикационной активности печень является органом-мишенью для множества заболеваний. Тяжесть клинических проявлений врожденных или приобретенных заболеваний печени зависит от объема поражения печеночной паренхимы и способности неповрежденных гепатоцитов и стволовых клеток органа компенсировать утрату путем пролиферации.
Результатом снижения функциональной активности печени ниже критического уровня является печеночная недостаточность, приводящая последовательно к тяжелым нарушениям работы центральной нервной системы, обмена веществ и в итоге — к смерти. В отличие от сердца, легких и почек, имеющих одну первичную функцию, у печени много жизненно важных для всего организма функций: обмен углеводов и жиров, синтез белков, обмен аминокислот, синтез мочевины, биотрансформация лекарств и токсинов, удаление отходов белкового, липидного и пигментного обменов. Печень в отличие от сердца и почек остается на сегодняшний день, пожалуй, единственным органом, чью функцию не удается успешно протезировать искусственным аппаратным комплексом.
В связи с бурным развитием хирургии печени в последние два десятилетия удалось установить многие механизмы стимуляции и торможения регенераторного потенциала фрагментов печени, а также развития печеночной недостаточности.
Неуклонным правилом хирургической гепатологии стало оставление у пациента не менее 1% массы печени от массы тела. В условиях фиброза или цирроза печени этот показатель необходимо удваивать или утраивать в зависимости от степени повреждения паренхимы. Меньший по объему пострезекционный фрагмент не регенерирует, состояние трактуется как «синдром малой доли, или small-for-size syndrome» и приводит к фатальной пострезекционной печеночной недостаточности.
Для профилактики развития такого состояния за последние 10 лет предложены технологии управляемой стимуляции гипертрофии перспективного фрагмента печени у пациента in situ. Наиболее часто применяется посегментарная эмболизация долевой ветви воротной вены (наиболее пораженной доли печени), приводящая к гипертрофии паренхимы контрлатеральной доли; для усиления эффекта возможна комбинация с окклюзионной эмболизацией соответствующей артерии. Наибольшей эффективностью обладает технология ALPPS (Associating Liver Partition and Portal vein Ligation for Staged hepatectomy), позволяющая за 7-9 дней добиться увеличения объема перспективной паренхимы на 78,4% и более.
В настоящее время наиболее эффективным и возможным методом лечения острой, пострезекционной и прогрессирующей хронической печеночной недостаточности является трансплантация печени. Выполняются трансплантации целого органа от умершего донора или его части от живого родственного или умершего донора с расчетом на гипертрофию печени в послеоперационном периоде.
При этом доступность трансплантации печени резко ограничена не только в нашей стране, но и за рубежом. Согласно исследованиям за истекшие 10 лет, каждый третий пациент не доживает до трансплантации, в основном из-за дефицита донорских органов и длительного процесса поиска совместимого донора.
В целях снижения уровня смертности среди пациентов с печеночной недостаточностью разрабатываются эффективные экстракорпоральные системы поддержки печени до момента трансплантации.
Физико-химические системы поддержки печени
На современном этапе в клинической практике для искусственного замещения функций печени используются отдельно или в комплексе следующие методы: диффузионные (гемодиализ), конвекционные (гемофильтрация), диффузионно-конвекционные (гемодиафильтрация), сорбционные (LPS-сорбция — сорбция липополисахаридных токсинов, плазмосорбция), диффузионно-конвекционно-сорбционные (альбуминовый диализ) и афферентные (плазмаферез). Все перечисленные методы основаны на использовании физико-химических взаимодействий биологических молекул, при этом из плазмы пациента удаляются уремические токсины малой и средней массы, малые белки, некоторые бактериальные эндотоксины.
Примером одной из известных и широко используемых систем детоксикации является модифицированная система фракционного плазменного разделения и адсорбции — Prometheus (Fresenius Medical Care, Германия). Система Prometheus состоит из диализного аппарата с интегрированным в него модулем для выделения и адсорбции альбумина. Данной системой удаляются альбуминсвязанные и водорастворимые токсины, что облегчает возможность регенерации гепатоцитов.
Также в Германии разработана и широко используется молекулярная абсорбирующая рециркулирующая система MARS (молекулярная система повторной циклической абсорбции), которая удаляет водорастворимые и альбуминсвязанные токсины. MARS применяется в клинической практике с 1993 г. Следует отметить высокую стоимость аппаратов и комплектов расходных материалов (несколько тысяч долларов за один сеанс), что ограничивает широкое применение этих систем. В России небольшое число клиник оснащены подобными системами для временной компенсации утраченной функции печени.
Все перечисленные физико-химические системы экстракорпоральной поддержки печени направлены на поддержание пациентов с печеночной недостаточностью в течение короткого временного промежутка, определяемого исходной тяжестью печеночной недостаточности.
Общими недостатками их являются:
- отсутствие нервных и гуморальных механизмов регуляции, а также связи с другими органами и системами;
- недостаточность детоксикационной мощности для остановки прогрессирования повреждений печеночной паренхимы.
Тем не менее при необходимости замещения функций печени существующие системы очистки крови являются единственным способом поддержания пациента до трансплантации.
В 1991 г. впервые была представлена технология временной трансплантации (подсадки) печени без удаления собственного поврежденного и частично некротизированного органа — Auxiliary partial orthotopic liver transplantation (APOLT). Метод основан на регенерации и восстановлении собственной печени в течение примерно четырех недель при фульминантной или молниеносной форме печеночной недостаточности.
Условием успеха является полное замещение функции печени в этом периоде. При восстановлении собственного органа, доказанном в ходе контрольных морфологических исследований биопсийного материала, трансплантированная донорская печень удаляется и пересаживается следующему нуждающемуся пациенту — «принцип домино». Несмотря на экзотичность метода, он демонстрирует свою высокую эффективность.
Ограничивающие факторы технологии APOLT: может использоваться в узкоспециализированных центрах при наличии уникальной хирургической техники. Метод, к сожалению, не нашел широкого применения в мировой практике.
Поскольку функции печени не исчерпываются исключительно детоксикацией, идеальная экстракорпоральная система должна также поддерживать метаболическую, синтетическую и регуляторную функции. В связи с этим с 80-х гг. XX века активно разрабатываются системы поддержки, совмещающие функции перфузии крови/плазмы и клеточные технологии.
«Биоискусственная печень»
Строение биореактора «искусственная печень»
В настоящее время разработаны системы поддержки печени с использованием живых культур гепатоцитов — биореакторы типа «искусственная печень». Технологические решения в конструкции биореакторов весьма разнообразны.
В целом биореактор можно определить, как объемную замкнутую систему, внутри которой выделяются две основные части: зона жизнедеятельности клеток и зона циркуляции плазмы или крови, ограниченные друг от друга полупроницаемой мембраной. После системной очистки крови (детоксикации, диализа) плазма или кровь пациента поступают в биореактор, где гепатоциты обогащают их продуктами синтеза. Из плазмы к гепатоцитам переносятся кислород, нутриенты и токсины, а желчные кислоты, факторы свертываемости крови, липопротеины, аминокислоты и другие продукты метаболизма гепатоцитов при этом поступают обратно в плазму.
Мембрана является барьером для различных веществ с большой молекулярной массой (транспортных белков, иммуноглобулинов, липопротеинов), для иммунокомпетентных клеток крови человека. В зависимости от заряда, размера и физико-химических свойств мембраны перенос веществ может осуществляться путем диффузии или конвекции и по градиенту концентрации. Транспорт кислорода, нутриентов, токсинов, продуктов жизнедеятельности гепатоцитов внутри зоны жизнедеятельности клеток осуществляется путем обычной диффузии.
Клеточные культуры в составе биореактора
В настоящее время основные усилия исследователей сосредоточены на выведении подходящих клеточных линий и развитии оптимальных условий их культивирования в составе биореактора. Особенности клеточного метаболизма являются актуальной темой многочисленных исследований, поскольку для эффективного выполнения биорегулирующей и синтетической функций клетки должны соответствовать нескольким критериям:
- выполнять функции нормального гепатоцита печени (детоксикация, синтез биологически активных веществ);
- быть способными активно пролиферировать (для накопления минимального объема — до 400 г биомассы в составе реактора);
- функционировать в условиях постоянного контакта с плазмой больных с острой печеночной недостаточностью.
Известно несколько подходов к созданию эффективно действующих клеточных линий в составе биореактора.
Использование аллогенных первичных гепатоцитов, выделенных из донорских тканей. С целью увеличения продолжительности жизни гепатоцитов от взрослого донора в некоторых работах описывается их обработка биологически активными веществами, в частности иммуносупрессантами FK506 и циклоспорином А.
Использование ксеногенных, имеющих животное происхождение первичных гепатоцитов. В подавляющем большинстве устройств действительно применяются первичные свиные гепатоциты. Данный выбор продиктован нехваткой гепатоцитов человека, сходством функций гепатоцитов человека и свиньи, доступностью последних.
Тем не менее использование свиных гепатоцитов сопряжено и с определенным риском. Согласно требованиям американской Системы контроля продовольственных и лекарственных средств (Food and Drug Administration— FDA), для применения свиных гепатоцитов в качестве клеточных линий должны использоваться определенные породы свиней, содержащиеся в надлежащих условиях. Это связано прежде всего с проблемой потенциального развития иммунного ответа у пациентов после перфузии их крови через ксеногепатоциты.
Важным также является вопрос защиты свиных гепатоцитов от действия потенциально активных факторов иммунной системы пациентов в период перфузии. Кроме того, хотя функции печени у всех млекопитающих и схожи, но различия все же существуют и ксеногенные гепатоциты не могут выполнять весь комплекс метаболических задач печени человека.
Использование иммортализованных и генетически модифицированных линий гепатоцитов животных и человека. Это направление на сегодняшний день является самым перспективным. Подобные клетки отличаются неограниченной, но управляемой способностью к делению, минимизируют риск передачи инфекции и сохраняют основные биологические характеристики и функции первичных гепатоцитов.
Для культивирования в условиях биореактора используются различные иммортализованные клеточные линии гепатоцитов: из клеток 8-дневного эмбриона свиньи создана линия PICM-19, разработаны человеческие иммортализованные линии гепатоцитоподобных клеток — HepZ, HepG2, cBAL111. Применяется также линия Chang Liver, созданная в 1954 г., однако эта линия, предположительно полученная из опухолевых клеток, имеет ограничения в применении из-за их онкогенного потенциала.
Все перечисленные способы получения специализированных монокультур имеют одну особенность: при их использовании отсутствие стимуляции роста гепатоцитов вызывает ограничение количества циклов пролиферации до восьми. Это не позволяет получить достаточное количество нормальных гепатоцитов для заполнения биореактора. К тому же кроме гепатоцитов в нормальной печени присутствуют и другие типы клеток, которые стимулируют их пролиферацию и дифференцировку (купферовские, стеллатные), но этих клеток нет при таких подходах.
Вместе с тем ведутся активные исследования по использованию в биореакторах отличных по происхождению клеток и по совместному культивированию нескольких типов клеток. В подобных исследованиях в качестве ко-культур широко применяются как специализированные, так и полипотентные типы клеток.
В экспериментальной работе показано, что одновременное культивирование мышиных гепатоцитов с непаренхимными (дуктальными, стеллатными и эндотелиальными) клетками человека в матригеле приводит к спонтанному формированию микросинусоидов, экспрессирующих альбумин и цитохромы Р450, а также микротканевых структур — предшественников желчных протоков и кровеносных сосудов.
Установлено, что совместное культивирование первичных гепатоцитов человека с эндотелиальными клетками желчных протоков способно благоприятно действовать на обе эти печеночные клеточные линии и стимулировать активное функционирование гепатоцитов. В исследованиях по совместному культивированию первичных гепатоцитов человека и мультипотентных мезенхимальных клеток костного мозга установлено, что выращиваемые в данных условиях гепатоциты обладают большим синтетическим и пролиферативным потенциалом.
Еще одним из путей получения гепатоцитоподобных клеток является использование стволовых клеток различного происхождения. Установлено, что направленная дифференцировка стромальных стволовых клеток костного мозга и жировой ткани позволяет получать клетки, коммитированные в гепатоцитарном направлении. Для осуществления подобной дифференцировки применяют фактор роста фибробластов FGF1, фактор роста гепатоцитов HGF, специализированные дифференцировочные среды. Для получения гепатоцитоподобных клеток также используют прогениторные клетки печени, являющиеся предшественниками гепатоцитов и клеток желчных протоков.
Однако существуют работы, в которых дифференцировка стромальных стволовых клеток в гепатоцитоподобные происходит за счет применения биологически активных материалов-носителей. В частности, при использовании децеллюляризованной (очищенной от клеток) печени крысы в качестве трехмерного каркаса для роста клеток было обнаружено, что такая биоподложка стимулирует направленную дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток в зрелые гепатоциты независимо от присутствия в культуральной среде факторов роста.
Особенности метаболизма клеток в составе биореактора
Клетки печени в естественных условиях испытывают высокую потребность в питательных веществах, кислороде и крайне чувствительны к изменениям концентрации метаболитов. Поэтому очень важно создать в системе биореактора условия, максимально приближенные к натуральным.
Питание. В живом организме питание клеток обеспечивается разветвленной капиллярной сетью. Расстояние от капилляров до клеток очень небольшое, поэтому кислород и нутриенты проникают в клетки путем диффузии. В искусственной системе такая капиллярная сеть отсутствует. Вследствие этого питательная среда неравномерно распределяется внутри клеточной массы, а синтезированные гепатоцитами вещества не могут в полной мере транспортироваться в кровь пациента.
Данная проблема решается несколькими путями, например, культивированием гепатоцитов на различных типах проницаемых подложек, а также постоянным перемешиванием среды культивирования.
Кислородное насыщение. Кислород в культуру поступает из газового слоя над поверхностью среды, и его поступление ограничено коэффициентом растворимости, который достаточно мал. В условиях повышенной клеточной плотности лишь небольшая часть клеток контактирует непосредственно с поверхностью раздела фаз и может получать кислород путем диффузии. Внутри клеточной массы, где клетки контактируют только друг с другом, кислород практически не переходит от клетки к клетке, в итоге создается острая гипоксия.
Решение этой проблемы достигается различными путями. Одним из вариантов является перемешивание среды, чтобы к переносу кислорода путем диффузии добавлялся перенос путем конвекции. В некоторых моделях биореакторов доступ кислорода к клеткам повышается за счет включения в конструкцию дополнительных источников кислорода, в других — используется прямое обогащение кислородом либо питательной среды, либо плазмы или цельной крови. В последнем случае внутри биореактора предусматриваются, например, отдельные пути подачи кислорода.
Скаффолды. Клетки внутри биореактора обычно прикрепляются к какому-либо носителю, замещающему экстрацеллюлярный матрикс. При этом классический монослой практически не используется, а применяется культивирование клеток в трехмерном пространстве, что способствует дифференциации, формированию межклеточных контактов и более высокой жизнеспособности клеток. Клеточные подложки, или скаффолды, могут быть разнообразны по форме и материалу.
- Скаффолды из природных материалов (коллаген, альгинат, фибронектин, желатин, матригель). Достоинство таких скаффолдов связано с эффективностью прикрепления клеток и их дальнейшей пролиферацией. Но прочность природных материалов недостаточна, а микроархитектура трудно воспроизводится.
- Скаффолды из биосовместимых синтетических материалов. К таким материалам относятся полимеры на основе алифатических полиэфиров: полилактид, полигликолид, их сополимеры и поликапролактон, синтетические полипептиды, стекло. Синтетические скаффолды более прочны, их можно формировать в соответствии с требованиями, обусловленными использованием конкретной клеточной линии.
- Скаффолды из смеси природных и синтетических материалов. Как правило, используются поликапролактон и коллаген, к ним добавляются некоторые другие компоненты, например, альгинат или хитозан.
На поверхности материалов должны быть созданы подходящие топологические, морфологические и биохимические условия для прикрепления и пролиферации клеток. Распространение по скаффолду зависит от скорости распределения клеток на его поверхности и скорости проникновения клеток в поры (наружный и внутренний транспорт). И если наружный транспорт зависит в первую очередь от материала носителя, то внутренний — от соотношения размеров поры и клетки.
Наиболее часто используются следующие группы скаффолдов. Первая группа представляет собой тонкие (2-3 мм толщиной) пластинки или диски с пористой поверхностью. Гепатоциты, высеваемые на подобную поверхность, заселяют поры, формируя кластеры.
Вторая группа — полые мембранные волокна, в которых гепатоциты культивируются на внутренней поверхности. В исследованиях последних лет используются нановолокна из смеси природных и искусственных полимеров. Подобные волокна собираются в трехмерные структуры различными методами, среди которых большую популярность приобретает электропрядение. Также при создании скаффолдов применяют методы инкапсулирования, когда гепатоциты заключаются в капсулы из фотополимеризуемых гидрогелей.
Использование нескольких клеточных культур в составе реактора может способствовать улучшению функционирования гепатоцитов. Например, применение фибробластов 3T3-J2 в качестве фидерного слоя приводит к увеличению секреции мочевины и альбумина гепатоцитами.
Экспериментально показано, что гепатоциты способны не только адгезироваться к поверхности материала, но и самоорганизовываться в кластеры. А при совместном культивировании гепатоцитов с эндотелиальными клетками образуются микрососуды и капилляры, таким образом имитируется ткань печени. Поэтому взаимодействие между различными типами клеток также должно учитываться при создании тканево-инженерных конструкций.
Конструкции биореакторов
Для эффективной работы биореактора необходимо, с одной стороны, оптимизировать транспорт питательных веществ и метаболитов к клеткам, а с другой — как можно более эффективно реализовать систему доставки плазмы к гепатоцитам. При достижении этого возникают некоторые технические проблемы, которые в разных типах реакторов решаются по-разному. Все конструкции биореакторов можно разделить на две большие группы — статические и динамические.
В статических биореакторах клетки (одиночные или организованные в сфероидные структуры) высевают на поверхность скаффолдов, где впоследствии они распространяются внутрь под действием силы тяжести и капиллярных сил. Скаффолды с клетками омываются средой и окружены полупроницаемой мембраной, через которую происходит обмен метаболитами. Поток плазмы или крови омывает мембрану, давая возможность кислороду, нутриентам и токсинам проникнуть к гепатоцитам. Продукты метаболизма клеток при этом поступают в плазму или кровь.
В динамических биореакторах клетки также высеваются на скаффолды, окруженные полупроницаемой мембраной, снаружи которой осуществляется ток плазмы или крови, а затем вся система приходит в движение. Используются магнитные мешалки или вращающийся корпус. Вращение скаффолдов приводит к лучшему распределению клеток внутри них: клетки проникают сквозь поры и занимают все полезное пространство скаффолда. Это способствует более высокой пролиферации клеток и увеличению срока их жизни.
Также вследствие постоянного вращения клетки лучше омываются питательной средой, эффективнее осуществляется обмен метаболитами между плазмой или кровью пациента и гепатоцитами. В результате клетки не испытывают кислородного голодания и недостатка питательных веществ. Большинство современных реакторов являются динамическими.
Разнообразие технических решений биореакторов
К настоящему времени в клинических условиях выполнено небольшое количество исследований, поэтому можно лишь предварительно оценить определенные успехи и дальнейшие перспективы. Первое сообщение о клиническом использовании «биоискусственной печени» опубликовано в 1987 г.
K.N. Matsumura с соавт. получили положительный эффект у пациента с печеночной недостаточностью, развившейся вследствие карциномы желчных протоков. Используемое устройство состояло из пластины диализатора с высокопроницаемыми целлофановыми мембранами, на которых были иммобилизованы гепатоциты.
В это же время группой под руководством M.S. Margulis были проведены клинические испытания «биоискусственной печени» на пациентах с острой печеночной недостаточностью. Биореактор состоял из колонки с активированным углем и суспензии гепатоцитов, удерживаемых с помощью нейлонового фильтра. Кровь пациентов перфузировалась через устройство в среднем 6 ч, замену колонки проводили через каждый час, поскольку суспензия единичных клеток быстро теряла метаболическую активность.
Gerlach в 1997 г. описан сложный четырехкомпонентный биореактор на основе полых мембранных волокон, взаиморасположение которых моделировало естественную сосудистую сеть. Трехмерная конструкция включала в себя волокна из полупроницаемой мембраны, организованные в плоские структуры. Повторяющимся элементом сети являлись три гидрофильных волокна, два из которых были заселены клетками, а третий предназначался для подачи кислорода и удаления углекислого газа.
Свиные или человеческие паренхиматозные и непаренхиматозные печеночные клетки культивировались на наружной части волокон. Плазма поступала в просвет мембранных пучков, фильтровалась через мембраны, омывала клетки и возвращалась к пациенту. Для данного реактора была установлена повышенная выживаемость клеток и эффективное использование имеющейся клеточной массы. Такой биореактор, засеянный человеческими гепатоцитами, был допущен к клиническим испытаниям, однако информации об их успешности нет.
Naruse с соавт. в 1998 г. описано устройство с использованием первичных свиных гепатоцитов, иммобилизованных на полиэфирном матриксе. Особенностями системы являлись предварительное формирование цилиндрической оболочки матрикса и последующее направление потока крови, находящегося вне оболочки, к внутренней ее части в радиальном реакторе. Для достаточного снабжения гепатоцитов кислородом проводили внешнюю оксигенацию. Использование этого метода позволило увеличить выживаемость свиней с ишемической моделью печеночной недостаточности.
В 1999 г. L.M. Flendrig с соавт. предложили другой тип биореактора, в котором свиные гепатоциты культивировались прикрепленными к спиральным волокнам из полиэфирных нетканых материалов, образующим трехмерную сеть. Вся конструкция была упакована в цилиндрический акриловый корпус. Внутри происходила непосредственная перфузия плазмы, текущей вдоль биореактора. Между соседними слоями волокон были вставлены микропористые мембраны для насыщения кислородом и удаления углекислого газа. При этом было зафиксировано образование гепатоцитами агрегатов, что приближало конструкцию биореактора к естественному строению печеночной единицы.
Naka с соавт. в 1999 г. разработали систему, использующую первичную культуру свиных гепатоцитов. В данной модели биореактора контакт гепатоцитов с плазмой осуществлялся через полисульфоновые мембраны. При этом первичные свиные гепатоциты в коллагеновом геле были размещены в просвете капилляров, а кровь перфузировалась через экстралюминальное пространство. Таким образом был организован дополнительный поток веществ и обеспечивались необходимые условия для функционирования гепатоцитов.
Поскольку коллаген способен к полимеризации, происходило полимеризационное сокращение количества геля и образование в просвете волокон канала, через который циркулировала питательная среда. Этот биореактор был успешно испытан на животных, в настоящее время ожидаются результаты клинических испытаний.
Iwata с соавт. также в 1999 г. создали сходную систему и опубликовали результаты исследований, в которых описали кинетику метаболических реакций гепатоцитов, культивируемых на картридже с экстралюминальным пространством.
Migashi с соавт. в том же 1999 г. использовали в своей работе культуру гепатоцитов, прикрепленных к матриксу из поливинилформальдегидной смолы. Материал кубической формы с прикрепленными к нему первичными гепатоцитами крыс размещали в специальной колонке. Исследования показали достаточно длительное (до 12 ч) сохранение метаболических функций гепатоцитов.
Компания Circe Biomedical использовала в своих аппаратах Hepat Assist криоконсервированные первичные свиные гепатоциты, прикрепленные к покрытым коллагеном декстрановым частицам. Есть данные о начальных этапах клинических испытаний этих аппаратов в 2000 г. (опыт лечения 39 больных с печеночной недостаточностью), но об успешном их прохождении не сообщалось.
Группой российских ученых в 2000 г. был запатентован аппарат «биоискусственная печень», который представляет собой биореактор колоночного типа. Рабочее тело биореактора состоит из емкости, заполненной частицами нейтрального носителя и гепатоцитами. В качестве частиц носителя используются стеклянные шарики диаметром 1-3 мм. Они создают объемную матрицу, в которой в пустотах между частицами формируются и удерживаются многоклеточные агрегаты гепатоцитов. Биологическая жидкость перфузируется через колонку сверху вниз и непосредственно омывает клеточные агрегаты, распределенные с помощью носителя по всему объему реактора. В настоящий момент реактор проходит клинические испытания.
Интересна система «биоискусственная печень», разработанная в Челябинске под руководством профессора В.Е. Рябинина, с которой проведены модельные эксперименты и исследования на животных. Принцип работы биореактора заключается в использовании полупроницаемой мембраны. С помощью этой методики осуществляется контакт крови пациента с контуром, в котором находится специальный биологический раствор, разработанный В.Е. Рябининым, — лиофилизированный цитозоль с микросомальной и митохондриальной фракцией гепатоцитов. Следует подчеркнуть, что система использует не гепатоциты, а только их органеллы, существенно отличаясь от биореакторов с клеточными компонентами.
В настоящее время применяемым на практике устройством, которое успешно прошло клинические испытания, является ELAD (Vital Therapies, Inc., США). В его основе лежит использование иммортализованной линии гепатоцитов человека, которые прикрепляются и растут в экстракапиллярном пространстве диализатора с полупроницаемой мембраной из полисульфона. Кровь больного поступает в устройство ELAD через катетер из яремной вены. В устройстве происходит отделение плазмы (жидкой части крови), которая направляется в диализаторы, содержащие около 440 г живых клеток.
Устройство разработано с целью обеспечения беспрерывной поддержки функции печени сроком до 30 дней у пациентов с острой или молниеносной формой печеночной недостаточности. Система призвана обеспечить сохранение функций печени, поддержать жизнь пациентов и защитить нервную систему от токсинов до момента трансплантации.
Заключение
С момента появления первых биореакторов прошло более двух десятилетий. За это время найдено много технических решений, усовершенствованы подходы к культивированию клеток. Созданы системы, прошедшие клинические испытания, и есть система, применяемая в медицине. Но нерешенными остаются многие проблемы в области клеточных технологий, связанные с увеличением долговечности культур гепатоцитов.
Для повышения срока сохранения функциональности гепатоцитов ведутся исследования по созданию биоактивных матриксов, разрабатываются новые инженерные решения в области систем снабжения клеток кислородом и необходимыми веществами. В перспективе есть вероятность, что аппарат «биоискусственная печень» будет применяться при лечении хронических заболеваний печени подобно аппарату «искусственная почка», используемому при лечении почечных заболеваний.
Е.В. Вилкова, Е.И. Черкасова, В.Е. Загайнов, Е.В. Загайнова
2013 г.